PCR (výskum) - aplikácia. Aká je technika PCR?

PCR je test, ktorý sa používa pri diagnostike mnohých chorôb. Metóda PCR umožňuje preukázať priamu prítomnosť baktérií v organizme, najmä v jeho DNA. PCR sa používa okrem iného pri diagnostike lymskej boreliózy. Aká je technika PCR? Čo je to PCR v reálnom čase?

Obsah:

1. PCR (testovanie) - aká je technika PCR?
2. PCR (výskum) - aplikácia metódy PCR
3. PCR (výskum) - borelióza
4. PCR (výskum) - výsledky. Môžu to byť falošné poplachy?
5. PCR (výskum) - výsledky. Môžu byť falošne negatívne

PCR (polymerázová reťazová reakcia) je základná metóda používaná v genetických a molekulárnych laboratóriách. Bol vyvinutý v roku 1983 Karou Mullisovou, ktorá zaň v roku 1993 získala Nobelovu cenu.

Vypočujte si, o čom je technika PCR. Toto je materiál z cyklu LISTENING GOOD. Podcasty s tipmi.

Ak chcete zobraziť toto video, povoľte JavaScript a zvážte inováciu na webový prehliadač, ktorý podporuje video

PCR (testovanie) - aká je technika PCR?

Testovanie PCR spočíva v mnohonásobnej amplifikácii (zvyčajne v 30-40 cykloch) špecifického fragmentu DNA, napríklad génov kódujúcich proteíny borélie, s použitím polymerázového enzýmu.

Potom sa na zviditeľnenie fragmentu amplifikovanej DNA použijú špeciálne molekulárne farbivá. PCR je z dôvodu amplifikácie špecifických fragmentov DNA ultra citlivá metóda.

Pri metóde PCR sa fragmenty DNA amplifikujú so špecifickými pármi primérov pre danú oblasť bakteriálnej DNA. Napríklad cieľové oblasti v PCR používané pri diagnostike lymskej boreliózy sú gény kódujúce proteíny, napr. 16S rDNA, recA, fla, p66, OspA.

Biologický materiál, z ktorého je možné vykonať test, je:

• krv
• časť kože z migrujúceho erytému
• mozgovomiechový mok
• synoviálna tekutina alebo z kĺbovej chrupavky
• moč

PCR (výskum) - aplikácia metódy PCR

Okrem diagnostiky lymskej boreliózy pomocou metódy PCR je možné detegovať špecifické fragmenty DNA iných mikroorganizmov alebo ľudí. Preto sa metóda PCR používa aj pri:

• diagnostika a sledovanie vírusových infekcií: herpesvírusy (herpes vírus, herpes zoster, Epstein-Barr, cytomegalovírus), HIV, vírusy hepatitídy (HBV a HCV)
• diagnostika a monitorovanie bakteriálnych infekcií, najmä tých baktérií, ktoré sa nedajú identifikovať pomocou kultúry, napr. tuberkulóza
• diagnostika a sledovanie neoplastických chorôb: leukémia, rakovina prsníka, rakovina hrubého čreva a konečníka, rakovina pľúc
• diagnóza predispozície na rakovinu: rakovina prsníka a vaječníkov (gény BRCA1 a BRCA2), kolorektálny karcinóm (gény APC a CHEK2)
• diagnostika genetických chorôb: hemochromatóza (gén HFE), talasémia (gény HBA1 a HBA2), celiakia (gény HLA)
• testy otcovstva, ktoré zisťujú DNA kompatibilitu dieťaťa a otca

Čítajte tiež: Testy na lymskú boreliózu - ako vyzerajú a aká je cena testov na lymskú boreliózu Western blot test a borelióza. Interpretácia výsledkov testu Kliešťové choroby: lymská borelióza, babezióza, bartonelóza, TBE a ďalšie.

V súčasnosti existuje veľa modifikácií metódy PCR. Napríklad pri diagnostike lymskej boreliózy sa používa hlavne nested PCR a PCR v reálnom čase. Druhá uvedená metóda je kvantitatívna a umožňuje určiť presný počet kópií DNA borélií v testovanom biologickom materiáli.

PCR (výskum) a borelióza

Sérologické testy sú základom pre diagnostiku boreliózy. Existujú však klinické situácie, ktoré môžu spôsobiť, že tieto testy budú falošne negatívne:

• sérologické okno, tj. počiatočné obdobie infekcie, v ktorej telo ešte neprodukuje špecifické protilátky IgM a IgG proti spirochétom Borrelia
• u ľudí s imunodeficienciou, ktorí neprodukujú dostatok protilátok
• prítomnosť imunitných komplexov, ktoré pozostávajú z antigénov Borrelia spirochetes a ich špecifických protilátok a bránia detekcii protilátok sérologickými metódami

Ak sú u pacienta podozrenie na príznaky lymskej boreliózy a výsledky sérologických testov sú negatívne, je možné vykonať molekulárne testovanie na základe metódy PCR.

DNA spirochét Borrelia sa dá zistiť v počiatočnom štádiu infekcie, pretože počet spirochet v telesných tekutinách je potom najvyšší.

Pri diagnostike lymskej boreliózy sa primárne používajú sérologické metódy, ako je ELISA, ale v niektorých klinických situáciách sú užitočné genetické testy pomocou metódy PCR.

Čím dlhší je čas od infekcie, tým je menšia pravdepodobnosť detekcie bakteriálnej DNA. Preto sa v niektorých prípadoch pred uskutočnením testu PCR množia baktérie na špeciálnom médiu po dobu 1-2 týždňov a potom sa vykoná test.

Tento prístup sa používa v prípade podozrenia na lymskú boreliózu a odobratú mozgovomiechovú tekutinu. V neskorej fáze infekcie je vhodnejšie vykonať test ELISA.

Metóda PCR by sa nemala používať pri bežnej diagnostike lymskej boreliózy kvôli chýbajúcej štandardizácii týkajúcej sa výskytu odrôd Borrelia burgdorferi v Poľsku.

V prípade ťažkostí s diagnostikou (najmä v počiatočnom štádiu ochorenia) však pomáha výsledok testu PCR v diagnostickom procese.

Pozitívny výsledok testu znamená, že v testovanom materiáli bola zistená prítomnosť DNA Borrelia burgdorferi a jej odrôd, ale nevysvetľuje, či v tele prebieha aktívna infekcia. Na druhej strane negatívny výsledok nevylučuje prítomnosť baktérií v tele.

Niektoré laboratóriá ponúkajú testovanie na prítomnosť DNA borélií v kliešťovi. Výsledok takéhoto vyšetrenia však nie je základom pre diagnostiku boreliózy u pohryzeného človeka.

Odporúčaný článok:

Test ELISA - čo zistí? Ako čítať výsledky? Cena testu

Výsledky PCR. Môžu to byť falošné poplachy?

PCR je ultra citlivá metóda a zároveň veľmi citlivá na kontamináciu. Preto je v testoch založených na PCR veľmi dôležité zvoliť vhodnú internú kontrolu na vylúčenie falošných pozitív.

Kľúčom je tiež správny zber materiálu na testovanie, ako aj skúsenosti a spoľahlivosť diagnostika, ktorý test vykonáva.

Výsledky PCR. Môžu byť falošne negatívne

Ako pri každom laboratórnom teste, aj pri metóde PCR sa môžu objaviť falošne negatívne výsledky. Tu je rozhodujúce odobrať krv pre vhodné antikoagulancium, pretože niektoré z nich, napríklad heparín, môžu inhibovať PCR reakciu.

Zhromažďovanie materiálu po začiatku antibiotickej liečby môže tiež spôsobiť zníženie účinnosti PCR reakcie a väčšiu pravdepodobnosť falošne negatívnych výsledkov.

Malo by sa tiež pamätať na to, že baktérie borélie žijú veľmi krátko v krvi a telesných tekutinách, pretože vďaka špeciálnym receptorom veľmi rýchlo prenikajú do „ťažko dostupných“ miest v tele.

Preto je na rozdiel od diagnostiky iných mikroorganizmov počet spirochét Borrelia v biologickom materiáli malý, niekedy dokonca na hranici detekcie metódy PCR. To môže tiež spôsobiť falošne negatívny výsledok.

Odporúčaný článok:

Test transformácie lymfocytov (LTT)

Literatúra

1. Dunaj J. a kol. Dôležitosť metódy PCR v diagnostike lymskej boreliózy. Prechádzať Epidemiol. 2013, 67, 119 - 123.
2. Laboratórna diagnostika chorôb prenášaných kliešťami. Odporúčania pracovnej skupiny: Národná komora laboratórnych diagnostikov, Národný ústav verejného zdravotníctva - Národný ústav hygieny, Národný konzultant v oblasti infekčných chorôb, Ústav infekčných chorôb a neuroinfekcií, Lekárska univerzita v Białystoku, Poľská virologická spoločnosť, Varšava 2014.
3. Ružić-Sabljić E. a Cerar T. Pokrok v molekulárnej diagnostike lymskej boreliózy. Expert Rev Mol Diagn. 2017 Jan; 17 (1): 19-30.
4. Valones M.A.A. et al. Princípy a aplikácie polymerázovej reťazovej reakcie v medicínskych diagnostických odboroch: prehľad. Braz J Microbiol. 2009 Jan-Mar; 40 (1): 1-11.

O autorovi

Karolina Karabin, MD, PhD, molekulárna biologička, laboratórna diagnostička, Cambridge Diagnostics Polska. Biologička so špecializáciou na mikrobiológiu a laboratórna diagnostika s viac ako 10-ročnými skúsenosťami v laboratórnej práci. Absolvent Vysokej školy molekulárnej medicíny a člen Poľskej spoločnosti pre genetiku človeka. Vedúci výskumných grantov v Laboratóriu molekulárnej diagnostiky na Katedre hematológie, onkológie a vnútorných chorôb Lekárskej univerzity vo Varšave. Na 1. lekárskej fakulte Lekárskej univerzity vo Varšave obhájila titul doktor lekárskych vied v odbore lekárska biológia. Autor mnohých vedeckých a populárno-vedeckých prác v oblasti laboratórnej diagnostiky, molekulárnej biológie a výživy. Denne ako špecialista v oblasti laboratórnej diagnostiky vedie testovacie oddelenie v spoločnosti Cambridge Diagnostics Polska a spolupracuje s tímom dietológov na CD Dietary Clinic. O svoje praktické poznatky z diagnostiky a dietoterapie chorôb sa delí s odborníkmi na konferenciách, školeniach, v časopisoch a na webových stránkach. Zaujíma ju najmä vplyv moderného životného štýlu na molekulárne procesy v tele.